【原理】

  鲎试剂( Tachypleus Amebocyte Lysate , TAL )是海洋节肢动物鲎血液中的阿米巴细胞( Amebocyte )经裂解液或机械方法裂解细胞后提取得到的一种细胞溶解物。鲎试剂中含有特异性的凝固酶,在一定条件下可被极微量的内毒素激活,当凝固蛋白原的精氨酸¹⁸-苏氨酸¹⁹和精氨酸⁴⁶-甘氨酸⁴⁷之间的肽键被切断后,则游离出含有28个氨基酸的C肽片段和凝固蛋白分子两端的A肽和B肽片段,并通过二硫键联结聚合成凝胶,其形成凝胶的速度和坚固程度与鲎试剂中凝固酶含量及内毒素浓度成正比。根据鲎试剂的这一特殊性质,可以方便、敏感地快速定性或定量检测检品中的内毒素含量。

【成分】

鲎阿米巴细胞溶解物	若干ml
20mmol/L氯化钙溶液	若干ml
154mmol/L氯化钠溶液	若干ml

【制法】

  1. 采血:新鲜健康成年的中国鲎(Tachypleus tri-denatus Leach),头胸-腹关节处以碘酒、酒精(70%)常规消毒,用16号兽用针头或特制玻管行心脏穿刺,使鲎血流入盛有抗凝剂(20mmol/L茶碱或25mmol/L乙二胺四乙酸钠, ED-TA比例为1:1(v/v)的无热原收集瓶中;

  2. 离心和洗涤:采血后立即离心,600g,5分钟,弃蓝色上清，见白色粉末状沉淀,加3.1%NaCI洗涤、离心两次,600g,5分钟,再次洗涤后进行细胞计数;

  3. 裂解:将5×10⁴/mm³细胞悬液100ml沉淀后,其压积细胞加入10ml裂解液(154mmol/L NaCl ,50mmol/L Tris-HCI pH7.1±0.3,10~100mmol/L CaCl₂),用力振荡后置4℃冰箱见24~72小时,取出2000g离心,15分钟,所得上清即为粗制鲎试剂;

  4. 精制:氯仿抽提后加20mmol/L氯化钙和154mmol/L氯化钠盐析,作敏感度检测后分装冻干保存。

【注意事项】

  1. 制备鲎试剂检测内毒素所用器皿,如玻璃离心管、针头、吸管、试管等,必须用酸、碱泡过后,250℃2小时或180℃4小时以上干烤,以彻底去除热原;

  2. 所用药品必须用干烤或活性炭吸附法等去除热原,尤其所用水必须经严格去热原并用标准内毒素与鲎试剂检测合格后方可使用;

  3. 加3.1%氯化钠溶液洗涤细胞时,应把玻璃管缓慢摆动或旋转,或用吸管冲洗,使沉淀(细胞)徐徐分散漂起,否则细胞破碎后易凝聚成块;

  4. 裂解时,加裂解液量不能按采血量加入,应按细胞压积计算,因为不同鲎血中所含细胞数量相差悬殊;

  5. 鲎试剂在液态下极不稳定,应该冻干保存并冷藏于-30℃以下避光处。

【用途】

  鲎试剂主要用来检测革兰氏阴性细菌内毒素(热原)。如用于脑脊液、尿液及血液中内毒素的检测;此外鲎试剂在药品、食品和水质热原检测中也广为应用,特别在家兔热原试验不能检测的检品中,如放射性药品、具有细胞毒性的抗癌药物等;用于基因工程产品的热原检测;是目前最灵敏、简便、可靠、快速而且能够定量的检测内毒素的理想试剂。根据我国卫生部(88)卫药政字第259号通知,目前规定4种大输液(注射用水、氯化钠注射液,5%和10%葡萄糖注射液)必须通过鲎试验检查合格后方可应用于临床。

  用鲎试剂检测内毒素一般用试管凝胶法较为简便,灵敏度不亚于其它方法,其步骤大致如下:

  将检品1:10梯度稀释,用标准内毒素和超纯水作阳、阴性对照,并作自凝试验,每管终量为0.1ml,再各加入0.1ml鲎试剂,充分摇匀,盖上玻璃帽,放37℃水浴1小时观察结果,并记录各管凝聚时间。形成坚固凝胶不流动者为++;混浊度和粘滞度均明显增加,呈胶体状倾斜试管可变形者为+;透明度无变化或稍混浊有少量颗粒絮片,液体流动自如者为-;再根据凝聚时间可定量检测检品中热原含量。

(第二军医大学 王梁华、焦炳华供稿)

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